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[中圖分類號]Q789-01 [文獻標識碼]A [文章編號]1009-5349（2014）11-0081-01

自Edward Jenne醫生發明天花疫苗開始，已有幾千種疫苗被開發出來，疫苗逐漸成為人類與疾病做斗爭的重要武器之一。傳統疫苗具有生產的成本高、疫苗中含強毒性致病物質、減毒株突變及部分疾病用傳統的疫苗防治收效甚微等缺點。所以，研制更安全、更高效的疫苗十分必要。

DNA重組技術為新一代疫苗――基因工程疫苗的研制提供了全新的方法。基因工程疫苗是指應用DNA重組技術，通過基因組改造，降低病原微生物的致病性，提高免疫原性，進而達到防治傳染病的目的。迄今為止，基因工程疫苗是最先進的疫苗，相比傳統疫苗而言它有巨大的優勢。

一、基因工程疫苗種類

應用基因工程技術開發的已經使用和正在研制的新型疫苗種類主要有基因工程亞單位疫苗、基因工程活載體疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、轉基因植物可食疫苗等。

（一）基因工程亞單位疫苗

該類疫苗僅包含病原體的抗原，不包含病原體的其他遺傳信息。基因工程亞單位疫苗通過表達病毒的主要保護性抗原蛋白獲得免疫原性，具有安全、便于規模化生產等優點。該類疫苗的制備步驟如下：①了解編碼具有免疫原活性的抗原蛋白對應的基因信息。②從大腸埃希氏菌、酵母、轉基因動植物等表達系統中選擇最適表達載體。如：酵母表達系統已經大規模生產人用重組肝炎疫苗。基因工程亞單位疫苗可細分為：細菌性疾病、病毒性疾病和激素亞單位疫苗。

1.細菌性疾病亞單位疫苗

分離和鑒定致病菌主要免疫原和毒力因子是研究細菌性亞單位疫苗的基礎，目前已研制出與炭疽、大腸桿菌病、牛布魯氏菌病等對應的亞單位疫苗，均能對相應的疾病產生有效的保護作用。史百芬等發現RSVF蛋白亞單位疫苗（PFP-1）注射接種后接種者無呼吸道疾病加劇作用。

2.病毒性疾病亞單位疫苗

大多數病毒基因組已經被克隆和完全測序，因此病毒性亞單位疫苗的研制相對簡單。現在病毒性疾病亞單位疫苗主要有口蹄疫、狂犬病、乙肝疫苗等。中國臺灣省科學家研制的禽流感亞單位疫苗效力遠比滅活疫苗高。祁賢等應用酵母系統表達生產雞傳染性腔上囊病病毒VP2亞單位疫苗，發現其可完全取代傳統滅活疫苗。

3.激素亞單位疫苗

該疫苗是以生長抑制素為免疫原的一類疫苗。杜念興等將大腸埃希氏菌中表達的生長抑制素基因與HbsAg基因融合，通過Vero細胞表達，結果發現表達產物具有良好的免疫原性。杜念興等用SS基因疫苗免疫小鼠，發現口服型SS基因疫苗免疫小鼠后可在小腸表達HBsAg/SS融合蛋白，推測該基因疫苗刺激機體表達蛋白后能產生SS抗體。

（二）基因工程活載體疫苗

此類疫苗生產主要有兩種方法，一是使非致病性微生物表達某種特定病原物的抗原決定簇基因，進而產生免疫原性，另一種是致病性微生物被修飾或去掉毒性基因，但仍保持免疫原性。活載體疫苗結合了活疫苗和死疫苗的共同優點，在免疫力上具有很大的優勢，分復制性和基因突變活載體疫苗。

（三）核酸疫苗

核酸疫苗接種后，抗原合成、增加與病原自然感染十分相似;還具有免疫原性單一;易構建和制備，穩定性好，成本低廉，適于規模化生產等優點。

二、展望

疫苗開發具有安全性、有效性、價廉性、易推廣性等特點。基因工程疫苗具有傳統疫苗無可比擬的優點，是疫苗產品開發的主要方向。研制多聯或多價疫苗是基因工程疫苗的主要發展方向。

【參考文獻】

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1 基因工程制藥

基因工程制藥開創了制藥工業的新紀元，解決了過去不能生產或者不能經濟生產的藥物問題。現在，人類已經可以按照需要，通過基因工程生產出大量廉價優質的新藥物和診斷試劑，諸如人生長激素、人的胰島素、尿激酶、紅細胞生成素、白細胞介素、干擾素、細胞集落刺激因子、表皮生長因子等。令人振奮的是，具有高度特異性和針對性的基因工程蛋白質多肽藥物的問世，不僅改變了制藥工業的產品結構，而且為治療各種疾病如糖尿病、腎衰竭、腫瘤、侏儒癥等提供了有效的藥物。眾所周知，醫治侏儒癥的良藥是人生長激素，倘若從人的尸體中獲取，治療一個病人就需要600具尸體的腦下垂體才能獲得足夠的量；倘若運用基因工程生產，就可從每升基因工程菌液中得到2．4g。人們為此而石破天驚的興奮!成本如此之低，又如此之高產，其巨大的經濟效益和社會效益，由此可見。

2 基因工程抗病毒疫苗

為人類抵御病毒侵襲提供了用武之地。基因工程乙型肝炎疫苗、狂犬病疫苗、流行性出血熱病毒疫苗、輪狀病毒疫苗等應用于臨床，提高了人類對各種病毒病的抵御能力。比如，乙型肝炎病毒疫苗的問世，使我國新生兒不再遭遇乙型肝炎病毒的侵襲，也降低了人群肝癌的發病率。又如，為治愈癌癥正在研制的用單克隆抗體制成的“生物導彈”，就是按照人類的設計，把“生物導彈”發射出去，精確地命中癌細胞，并炸死癌細胞而不傷害健康的細胞。就單克隆細胞而言，單克隆細胞在腫癌的診斷檢測、顯示定位、監測病變、監測療效等方面也有重要價值。人類還通過基因工程生產抵御各種病菌、血吸蟲、虐原蟲等疫苗，提高人體對各種傳染病的免疫力。脫氧核糖核酸或者基因疫苗的問世，變革了機體的免疫方式。如今，人們翹首關注困擾人類的艾滋病病毒(人類免疫缺陷病毒)疫苗的早日問世。基因工程抗體技術的發展，為克服單克隆抗體生產細胞株在生產過程中的不穩定性，為生產大量高效抗病毒疫苗提供了先進的生產工藝。

3 基因工程治療疾病

臨床實踐已經表明，基因治病已經變革了整個醫學的預防和治療領域。比如，不治之癥——白癡病，用健康的基因更換或者矯正患者的有缺損的基因，就有可能根治這種疾病。現在已知的人類遺傳疾病約有4000種，包括單基因缺陷和多基因綜合征。運用基因工程技術或者基因打靶的手段，將病毒的基因殺滅，插入校正基因，得以治療、校正和預防遺傳疾病的目的。人類精心設計的基因工程操作，克服了不同個體甚至物種之間由于器官移植所產生的免疫排斥作用，實現人體之間的移植已獲成功，成功的實體器官移植有腎、心、肝、胰、肺、腸，也有雙器官和多器官的聯合移植。而人體與動物之間的器官移植成為現實，臨床應用已是指日可待的事了。脫氧核糖核酸化學合成的完善和自動化，脫氧核糖核酸擴增技術的優化，為合成基因“探針”，提高臨床診斷的質量，是人類所殷切企盼的。基因治療有兩種途徑，一是體細胞的基因治療，二是生殖細胞的基因治療。體細胞的基因治療是將正常的遺傳基因導入受精的卵細胞內，讓這種遺傳物質進入受精卵的基因組內，并隨著受精卵分裂，分配到每一個子細胞中去，最終糾正未來個體的遺傳缺陷。而生殖細胞的基因治療是將人類設計的“目的基因”導入患有遺傳病病人的生殖細胞內，此法操作技術異常復雜，又涉及倫理，緩行之理充足，故尚無人涉足。

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中圖分類號：94 文獻標識碼：B 文章編號：1009-9166（2009）02（c）-0069-02

一、醫藥生物技術

醫藥生物技術是生物技術首先取得突破，實現產業化的技術領域。在現代醫藥生物技術中，當前最活躍、應用最廣泛的為基因工程技術和細胞工程技術，人們利用基因改造后的生物體可以制備大量的新的基因工程藥物(所謂基因工程藥物就是先確定對某種疾病有預防和治療作用的蛋白質，然后將控制該蛋白質合成過程的基因取出來，經過一系列基因操作，最后將該基因放入可以大量生產的受體細胞中去，這些受體細胞包括細菌、酵母菌、動物或動物細胞、植物或植物細胞，在受體細胞不斷繁殖過程中，大規模生產具有預防和治療這些疾病的蛋白質，即基因疫苗或藥物)，進而生產各種導向藥物，各種特異性的免疫診斷試劑、核酸檢測試劑、生物芯片等。基因工程藥物已經走進人們的生活，利用基因治愈更多的疾病不再是一個奢望。

1、生物技術藥品的生產。基因工程藥品的生產，包括干擾素、白細胞介素、紅細胞生成素、血小板生成素四個藥品以及基因工程。利用基因工程、酶工程、發酵工程和蛋白質工程對傳統醫藥產業進行技術改造，成為現代生物技術制藥產業的包括維生素c、激素類藥品和抗生素的生產以及氨基酸生產等。利用現代生物技術的提取、分離、純化等下游技術使生化制劑升級換代。其中，乙肝疫苗形成了基因工程產品體系。它是基因工程藥物對人類的貢獻典例之一，以下將以此為例說明基因工程藥物的應用：像其他蛋白質一樣，乙肝表面抗原（HBSAg）的產生也受DNA調控。利用基因剪切技術，用一種“基因剪刀”將調控HBSAg的那段DNA剪裁下來，裝到一個表達載體中，再把這種表達載體轉移到受體細胞內，如大腸桿菌或酵母菌等；最后再通過這些大腸桿菌或酵母菌的快速繁殖，生產出大量我們所需要的HBSAg（乙肝疫苗）。過去，乙肝疫苗的來源，主要是從HBV攜帶者的血液中分離出來的HBSAg，這種血液是不安全的，可能混有其他病原體[其他型的肝炎病毒，特別是艾滋病病毒（HIV）的污染。此外，血液來源也是極有限的，使乙肝疫苗的供應猶如杯水車薪，遠不能滿足全國的需要。基因工程疫苗解決了這一難題。而且基因工程乙肝疫苗（酵母重組）與血源乙肝疫苗可互換使用。據臨床報道，基因工程乙肝疫苗（酵母重組）能夠成功地加強由血源乙肝疫苗激發的免疫反應，對一個曾經接受過血源乙肝疫苗的人，完全可以換用基因工程乙肝疫苗（酵母重組）來加強免疫。臨床研究表明，人體對基因工程乙肝疫苗（酵母重組）有很好的耐受性，無嚴重副反應出現，表明基因工程乙肝疫苗（酵母重組）是非常安全的，在我國基因工程乙肝疫苗已使用1500萬人份以上，如此大規模接種，尚未出現嚴重副反應報道。正是基于1996年我國已有能力生產大量的基因工程乙肝疫苗，我國才有信心遏制這一威脅人類健康最嚴重、流行最廣泛的病種。大量臨床資料表明：它是一種安全有效的制品，它的抗體陽轉率在95%以上，母嬰阻斷率在85%以上，它能降低乙肝感染率、攜帶率，成為控制乙肝的一種重要手段。基因工程乙肝疫苗（酵母重組）因是一個新產品，有關免疫持久性試驗仍在進行之中，從所觀察5年資料看，可以保護5年，是否能保護更長時間仍需實驗證實。科學研究表明：基因工程乙肝疫苗（酵母重組）可刺激人體產生免疫記憶反應，因此，長期受益是可能的。2、醫藥生物技術的帶動作用。隨著現代生物技術的應用，必然引起一些產業的發展。例如，隨著醫療診斷水平的提高，酶診斷試劑和免疫診斷試劑的生產必然達到更高水平；海洋藥物和中藥的開發應用技術也會有所改進；保健品的生產也已顯出強勁的勢頭。3、展望。人類基因組測序工作的完成，人們期待已久的人類基因密碼的破譯，會使我們對人的健康與疾病起因有更深入的認識，隨之而來的將是更多的新防治藥物的產生和新療法的問世，為基因工程制藥產業帶來新的發展契機。然而，第一張人類基因組測序工作草圖尚未弄清所有人類基因的功能，一旦人的基因產物（即活性蛋白質）被表達出來，將會有幾千種具有特殊療效的現代藥物誕生。我們樂觀地期待著這場新藥革命的來臨。

二、食品生物技術

食品生物技術就是通過生物技術手段，用生物程序、生產細胞或其代謝物質來制造食品，改進傳統生產過程，以提高人類生活質的科學技術。生物技術在食品工業中的應用首先是在基因工程領域，即以DNA重組技術或克隆技術為手段，實現動物、植物、微生物等的基因轉移或DNA重組，以改良食品原料或食品微生物。如利用基因工程改良食品加工的原料、改良微生物的菌種性能、生產酶制劑、生產保健食品的有效成分等。其次是在細胞工程的應用，即以細胞生物學的方法，按照人們預定的設計，有計劃地改造遺傳物質和細胞培養技術，包括細胞融合技術及動、植物大量控制性培養技術，以生產各種保健食品的有效成分、新型食品和食品添加劑。再次是在酶工程的應用。酶是活細胞產生的具有高度催化活性和高度專一性的生物催化劑，可應用于食品生產過程中物質的轉化。繼淀粉水解酶的品種配套和應用開拓取得顯著成效以來，纖維素酶在果汁生產、果蔬生產、速溶茶生產、醬油釀造、制酒等食品工業中應用廣泛。最后是在發酵工程的應用，即采用現酵設備，使經優選的細胞或經現代技術改造的菌株進行放大培養和控制性發酵，獲得工業化生產預定的食品或食品的功能成分。還有一些功能性食品如高鈣奶、蜂產品、螺旋藻、魚油、多糖、大豆異黃酮、輔酶Q10等。

作為一項極富潛力和發展空間的新興技術，生物技術在食品工業中的發展將會呈現出以下趨勢：

1、大力開發食品添加劑新品種。目前，國際上對食品添加劑品質要求是：使食品更加天然、新鮮；追求食品的低脂肪、低膽固醇、低熱量；增強食品貯藏過程中品質的穩定性；不用或少用化學合成的添加劑。因此，今后要從兩個方面加大開發的力度，一是用生物法代替化學合成的食品添加劑，迫切需要開發的有保鮮劑、香精香料、防腐劑、天然色素等；二是要大力開發功能性食品添加劑，如具有免疫調節、延緩衰老、抗疲勞、耐缺氧、抗輻射、調節血脂、調整腸胃功能性組分。2、發展微生物保健食品微生物食品有著悠久的歷史，醬油、食醋、飲料酒、蘑菇都等屬于這個領域，它們與雙歧桿菌飲料、酵母片劑、乳制品等微生物醫療保健品一樣，有著巨大的發展潛力。微生物生產食品有著獨有的特點，繁殖過程快，在一定的設備條件下可以大規模生產；要求的營養物質簡單；食用菌的投入與產出比高出其它經濟作物；易于實現產業化；可采用固體培養，也可實行液體培養，還可混菌培養；得到的菌體既可研制成產品，還可提取有效成分，用途極其廣泛。3、轉基因生物技術為農業、醫學及食品等行業的騰飛注入了新的動力，直接加快了農業新品種的培育改良、各種疾病的防治、食品營養改善和生態環境管理。轉基因技術的開發可以加速農業、林業和漁業的發展，提高農作物產量，進而通過未來基因食品解決發展中國家人民的饑餓以及營養不良等問題。現時最普遍的轉基因食品是大豆及玉米，占總數量的八成。加上棉花、油菜加在一起達到99%，還有番茄，如抗黃瓜花葉病毒的番茄和一種晚熟的番茄；還有也是抗黃瓜花葉病毒矮牽牛的甜椒；另外，也有一些獸用的飼料添加劑和微生物的農用產品。其中食用油是其中比較大的一塊。食用油業內人士指出，目前食用油中約有80%~90%為轉基因食品，這是由于目前市場上占主導地位的調和油、大豆色拉油，大部分是采用含轉基因的原材料制成的。消費者要在超市里買到一瓶非轉基因大豆油并不容易。因為目前的大豆色拉油、調和油其主要原料都是進口轉基因大豆。由于目前市場上還沒有轉基因的有花生、橄欖及葵花子，因此所有花生油、橄欖油及葵花子油都屬于非轉基因食品。一些產品，也可能與轉基因有關，如餅干、即溶飲品及沖調食品，飲料和奶制品，啤酒，嬰兒食品及奶粉，膨化食品與零食，糖果、果凍和巧克力、雪糕等。

食品生物技術如同一把雙刃劍，有利也有弊。轉基因食品是不是有利，取決于轉什么基因，或者基因轉到什么食品里。因此，政府應該采取積極措施，隨時公開基因食品的研究成果，以足以博取信任的方式與公眾進行溝通。總之，生物技術已深入到食品工業的各個環節，對食品工業的發展發揮越來越重要的作用。隨著它的不斷發展，必將給人們帶來更豐富，更有利于健康，更富有營養的食品，并帶動食品工業發生革命性變化。展望21世紀基因食品的發展，未來生物技術不僅有助于實現食品的多樣化，而且有助于生產特定的營養保健食品，進而治病健身。

作者單位：中國藥科大學

作者簡介：童欣（1987年-），女，漢族，廣東樂昌人，中國藥科大學生科院2005級生物技術本科生

參考文獻：

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截至2003年，我國批準上市的基因工程藥物和疫苗主要有重組人a－lb干擾素、重組人表皮因子（外用）、重組人紅細胞生成素、重組鏈激素、重組人胰島素、重組人生長激素、重組乙肝疫苗等。目前，全球最暢銷的十幾種基因藥物在我國都能生產。

基因藥物成為人類對付疾病的新銳，一般來說基因藥物，都應有自己特有的作用靶點，或是人體組織、或是細胞膜、或是細胞漿中的某蛋白質和酶。通過這些作用點，藥物能發揮最佳療效。而現有的藥物除了作用于治療的目標點之外，還常常作用于其他部位，因此常常會帶來很多的副作用。

基因工程制藥將具有藥物作用效果明確、作用機理清楚或作用專一、毒副作用小等優點。這些藥物會使醫生能像發射激光制導“導彈”那樣使用藥物，而不是盲目對疾病“開火”。

而且，基因工程制藥不僅解決傳統藥物“頭痛醫頭腳痛醫腳”的治標問題，還將從基因的個性化角度配制藥物，使疾病得到徹底根治，并同時帶來制藥產業的革命。

從提高人類生存質量角度看，基因工程制藥目前主要瞄準一些重大的常見疾病，如艾滋病、癌癥、糖尿病、抑郁癥、心臟病、老年性癡呆癥、中風、骨質疏松癥等嚴重危害人類健康并流行范圍較廣的病癥。

尋找新的藥物作用靶點是今后新藥研制開發的關鍵。而人類基因組學研究將為尋找新的藥物作用點開辟廣闊的前景，它最終揭示的人類基因中至少有幾千個基因可作為藥物的作用點。

基因工程制藥產業發展迅速，得益于我國舉世矚目的基因技術研究實力。我國是唯一參與人類基因組研究的發展中國家，在參與人類基因組計劃的美、英、日、中、法、德6個國家中，我國基因組測序能力已經超過法國和德國，名列第四。在6國16個基因組測序中心里，我國位居前十強。2000年完成了1％的人類基因組測序任務，2002年又獨立完成了水稻基因組研究。如今又領銜國際人類肝臟蛋白質組研究，這些都是舉世矚目的成就。尤其近年來，在醫學和生命科學的幾大最前沿的領域，如組織器官工程、生物芯片、干細胞技術、克隆技術等方面也均處于世界先進水平。加上基因重組技術、DNA技術、基因化學技術的進步和發展等，這些都將為我國基因工程藥物產業的發展奠定堅實的科學技術基礎，將給基因工程藥物產業帶來深刻的變化和前所未有的發展機遇。

盡管國內基因工程制藥企業現狀不容樂觀，我國生物技術產業與歐美發達國家相比雖有一定距離，但并非不可逾越，這個市場依然被業內人士十分看好。比如我國干擾素的實際消費量不足1億，但市場潛力相當大，專家們估計能達到4億―5億支。尤其經過近10年的努力，我國已造就了若干個具有國際競爭力，甚至能躋身世界基因工程藥物產業前列的中國本土上的龍頭企業。所以盡管基因工程制藥發展道路艱辛，但前景依然十分誘人。

1基因工程與基因板塊前景分析

1.基因工程技術的發展與前瞻性，2000年6月26日，“人類基因組計劃”成功繪制了人類生命的“天書”，人類的遺傳密碼基本被破譯，標志著生物技術，特別是生命科學技術發展進入到一個新的階段。人類基因組計劃（HGP）與曼哈頓原子彈計劃和阿波羅登月計劃一起被稱為二十世紀三大科學工程，它同時將貫穿于整個21世紀，被認為是21世紀最偉大的科學工程。早在20世紀上半葉，遺傳學家就提出了“基因”概念，即基因是決定生物性狀的遺傳物質基礎。特別是1953年沃森和克里克DNA雙螺旋結構模型創立后，進一步從本質上證實基因是決定人類生、老、病、死和一切生命現象的物質基礎。至70年代，DNA重組技術（也稱基因工程或遺傳工程技術）終獲成功并付之應用，分離、克隆基因變為現實，不少遺傳病的致病基因及其他一些疾病的相關基因和病毒致病基因陸陸續續被確定。所有這一切使人們似乎看到了攻克頑癥的曙光，研究基因的熱情空前高漲。

諾貝爾獎獲得者杜伯克進一步提出了基因組研究模式，美國國會于1990年10月1日批準正式啟動HGP，為期15年，政府投資30億美元。人類基因組計劃的目的是要破譯出基因密碼并將其序列化制成研究藍本，從而對診斷病癥和研究治療提供巨大幫助。不久的將來我們不僅可以看到癌癥、艾滋病等絕癥被攻克；人類可以通過基因克隆復制器官和無性繁殖；基因診斷和改動技術可以使人類后代不再受遺傳病的困擾；而且人類將進入藥物個性化時代，人類的生命也將延長。正是由于這些新技術和新領域的不斷出現和日新月異，人類在新世紀的生存和生活方式將發生重大變化。

其一、基因制藥。在過去發現新藥物作用靶點和受體是非常昂貴和漫長的，科學家只是依賴試錯法來實現其藥物研究和開發的目標。人類基因組研究計劃完成后，科學家可以直接根據基因組研究成果確定靶位和受體設計藥物。這將大大縮短藥物研制時間和大大降低藥物研制費用。

其二、基因診斷。人類基因組研究計劃最直接和最容易產生效益的地方就是基因診斷。通過基因診斷可以解決遺傳性疾病的黑洞，基因診斷能夠在遺傳病患者還未發現出任何癥狀之前，甚至還未出生的嬰兒就能確診。

其三、基因治療。基因治療被稱為人類醫療史上的第四次革命，遺傳學表明人類有6500種遺傳性疾病是由單個基因缺陷引起的，而通過基因治療置入相關基因將使人類的許多不治之癥得以克服。

其四、基因克隆。是指把一個生物體中的遺傳信息（DNA）轉入另一個生物體內。利用基因克隆技術不僅可以培育出自然界不可能產生的新物種，而且可以培養帶有人體基因的動植物作為“生物反應器”生產基因工程產品，還可制造用于人體臟器移植的器官，從而解決異體器官的排斥和供移植的人體器官來源不足的問題。現在動植物克隆已成為現代科技進步中最具有沖擊力和爭議性的事件，克隆羊和克隆豬的出現引發人類克隆自身的擔憂，而植物克隆和大量轉基因食物大規模出現引發了人們對于生物物種混亂和污染的擔憂。但不可否認的是，植物克隆可以為人類食品來源開啟廣闊的空間，而動物克隆可以利用動物生產大量人類需要的基因藥物和器官。

其五、基因芯片。由此可見，在21世紀誰能掌握人類自身，誰擁有基因專利越多，誰就在某種基因的商業運用和新藥開發中居于領導地位，基因技術具有巨大商業價值和社會意義。

2中國基因工程產業的發展態勢

1999年7月，我國在國際人類基因組注冊，承擔了其中1％的測序任務。我國人類基因組研究除完成3號染色體3000萬個堿基對即1％的測序任務外，主要著重于疾病相關基因以及重要生物功能基因的結構和功能研究。我國近兩年又在上海和北京相繼成立了國家人類基因組南、北兩個中心，這為大規模進行基因功能研究提供了可靠的保證。

基因技術革命是繼工業革命、信息革命之后對人類社會產生深遠影響的一場革命。它在基因制藥、基因診斷、基因治療等技術方面所取得的革命性成果，將極大地改變人類生命和生活的面貌。同時，基因技術所帶來的商業價值無可估量，從事此類技術研究和開發企業的發展前景無疑十分廣闊。基因工程產業除了眾所周知的高投入、高回報、高技術、高風險外，還具有其它一些十分重要和鮮明的特點。基因工程產品的技術含量非常高，因此，基因工程產品的前期研究和開發投入非常高，國外新藥的研究開發費用基本上占銷售額的15％左右。而基因工程產品的直接生產成本卻非常低，而且對生產的設備要求也不是很高，基因產品的這一特點意味著基因工程領域的進入壁壘并不存在于生產領域，而存在于該產業的上游，即研究開發這一環節，因此只有具備相當資金與技術實力的企業才能問津。基因工程產業不僅在投入上具有非常明顯的階段性，而且基因工程產品的創新期非常長，因為不僅產品的研究開發需要花費大量的時間和精力，而且對產品的審批也相當嚴格，所以一種基因工程產品完成創新階段，從實驗室到消費者手中要經過好幾年時間。

由于基因工程產業的發展前景十分看好，因此一大批國內企業包括許多上市公司近年來紛紛涉足這一行業。自九十年代中期以來，我國已有300多家生物工程研究單位，200多家現代生物醫藥企業，50多家生物工程技術開發公司，上市公司中有30多家企業涉及生物制藥。目前，基因工程藥物、生物疫苗、生物診斷試劑三大類的基因產品均有國內企業參與生產。在這些產品的市場上，國內企業依靠低廉的價格和廣闊的營銷網絡，已在與國外廠商的市場競爭中取得了優勢地位。從行業分布上來看，國內上述幾類基因工程產品的市場格局大致呈現如下的狀況：

細胞因子類產品目前市場已處于飽和狀態。受超額利潤的誘惑，前兩年已有太多的廠家介入該市場，僅EPO一項，光上市公司在生產的就有復星實業（600196）、哈醫藥（600664）、張江高科（600895）、等好幾家，再加上國內非上市公司，目前共有十幾家公司在生產EPO，年生產能力過剩超過了500萬支。而血小板生長因子（TPO），由于國外的知識產權保護而未能為國內廠商所仿制，從而導致該產品被進口品所壟斷。因此，如果不能形成新細胞因子的自主開發能力，對企業來說，該市場的拓展空間將非常有限。

重組類藥物目前還處于實驗室開發階段。目前市場上的水蛭素、降鈣素等產品是通過提取或化學合成，而不是利用基因工程技術的方法獲得的。有許多院校和研究機構已在這方面取得了一定的進展，拿到了目的基因并在實驗室構建了表達載體，但在表達量及分離純化方面還有待突破。可見部分重組類藥物的產業化生產已不再遙遠，國內在這方面與國外的差距還不算大，是一個大有可為的新領域。

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轉基因作物的研究規模已達到了空前的水平。自1983年世界上第一例轉基因抗病毒植物誕生以來，轉基因作物的研制、中間試驗、田間釋放和商業化種植得到了迅速的發展，到1997年底，轉基因植物已達幾百種；轉基因作物于1986年在美國和法國首次進入大田試驗，到1997年底全世界轉基因作物的田間試驗已達25000多例；1994年，美國批準了轉基因延熟番茄的商業化生產，到1997年底，全世界共有51種轉基因植物產品被正式投入商品化生產。

轉基因作物的種植面積正在迅速擴大。全世界轉基因作物的種植面積在1995年僅為1.2×106hm2，1996年為2.84×106hm2，1997年為1.25×107hm2，1998年為2.78×107hm2，1999年增至3.99×107hm2.2000年進一步增至4.42×107hm2，2001年已達5.26×107hm2.2001年全球轉基因作物按作物種類統計為：大豆占46%，棉花占20%，油菜占11%，玉米占7%；按國家統計：美國占70%（面積，下同）、阿根廷占22%、加拿大占6%、中國占1%～3％，上述4國占全球轉基因作物種植面積的99%；按目標性狀分類：抗除草劑轉基因作物占77%，抗蟲轉基因作物占15%.據統計，1999年美國轉基因大豆、棉花和玉米的種植面積，分別占該國相應作物種植面積的55%、50%和30%。

轉基因作物具有巨大的經濟效益，1997年美國轉基因抗蟲棉種植面積為1×106hm2，平均增產70%，每公頃抗蟲棉可增加凈收益83美元，直接經濟效益近1億美元；1998年美國種植轉基因抗蟲玉米達5×106hm2，平均增產9%，其凈收益為68.1美元／hm2，可產生直接經濟效益3.4億美元。1995年全球轉基因作物的銷售額僅為0.75億美元，1998年達到12億美元～15億美元，2000年已達30億美元，5年間增加了40倍。預計2005年將達60億美元，2010年將達到200億美元。 

2.植物用轉基因微生物 

自上世紀80年代以來，重組農業微生物工程研究取得了突破性進展，其中新型重組固氮微生物研究已進入田間試驗，一些殺蟲、防病遺傳工程微生物進入田間試驗或商業化生產。防凍害基因工程菌株已于1987年進入田間試驗，防治果樹根癌病工程菌株也于1991年和1992年先后在澳大利亞和美國獲準登記，目前已在澳大利亞、美國、加拿大和西歐一些國家銷售，這是世界上首例商品化生產的植病生防基因工程細菌制劑。具有殺蟲活性的轉b.t基因工程細菌，自1991年起已有多個產品進入市場。在高銨條件下仍保持良好固氮能力的耐銨工程菌株，也進入田間試驗。 

3.轉基因動物

轉基因動物主要應用于以下幾個方面：改良動物品種和生產性能；生產人藥用蛋白和營養保健蛋白；生產人用器官移植的異種供體；建立疾病和藥物篩選模型；生產新型生物材料等。1998年全球動物生物技術產品總銷售額約為6.2億美元，預計2010年總銷售額將達到110億美元，其中75億美元是轉基因動物產品。

4. 獸用基因工程生物制品

獸用基因工程生物制品是指利用重組dna技術生產的獸用免疫制劑。主要包括：單克隆抗體等診斷試劑，目前國內外正在研究、開發或已應用的單克隆抗體診斷試劑已達1000多種；基因工程疫苗，已有44例獲準進行商品化生產，其中重組亞單位疫苗30例，基因缺失活疫苗12例，基因重組活疫苗2例。此外，還有dna疫苗和獸用基因植物源生物制品等。 

5. 轉基因水生生物 

迄今為止，全世界研究的轉基因水生生物達20余種，已有8種進入中間試驗，其中我國有一種兩例，僅有大西洋鮭1種可能已開始小規模商品化生產。

6. 我國農業轉基因生物研發現狀與產業化概況

我國轉基因植物的研究開發始于20世紀80年代，1986年啟動的863高新技術計劃起到了關鍵性的導向、帶動和輻射作用。據1996年統計，國內正在研究和開發的轉基因植物約47種，涉及各類基因103種。1997年～1999年，有26例轉基因植物獲準進行商業化生產。按轉基因性狀分：抗蟲16例，抗病毒9例，改良品質1例。按作物劃分：棉16例，番茄5例，甜椒4例，矮牽牛1例。

轉基因抗蟲棉是國內植物基因工程應用于農業生產的第一個成功范例，使我國成為繼美國之后獨立研制成抗蟲棉，并具有自主知識產權的第二個國家。1998年～2001年4年累計種植逾1.3×106hm2，減少農藥使用量70%以上，產生了巨大的社會、經濟和生態效益。由于其傘形輻射的帶動作用，抗蟲轉基因水稻、玉米、楊樹等一批后繼轉基因產品正在進行田間試驗，蓄勢待發。轉基因技術將使農業產業發生深刻的結構變化，向農業與醫藥、農業與食品、農業與加工結合的方向發展。

我國植物用轉基因微生物研究已取得長足進展，正在研發的防病殺蟲微生物13種，涉及基因16種；固氮微生物8種，涉及基因12種，大多已進入中間試驗和環境釋放試驗。我國獸用基因工程生物制品研究與產業化進展迅速，已有近70種單克隆抗體等診斷試劑投放市場，2例基因工程疫苗獲準進行商品化生產，其中重組亞單位疫苗1例，基因重組活疫苗1例。

篇6

轉基因作物的研究規模已達到了空前的水平。自1983年世界上第一例轉基因抗病毒植物誕生以來，轉基因作物的研制、中間試驗、田間釋放和商業化種植得到了迅速的發展，到1997年底，轉基因植物已達幾百種；轉基因作物于1986年在美國和法國首次進入大田試驗，到1997年底全世界轉基因作物的田間試驗已達25000多例；1994年，美國批準了轉基因延熟番茄的商業化生產，到1997年底，全世界共有51種轉基因植物產品被正式投入商品化生產。

轉基因作物的種植面積正在迅速擴大。全世界轉基因作物的種植面積在1995年僅為1.2×106hm2，1996年為2.84×106hm2，1997年為1.25×107hm2，1998年為2.78×107hm2，1999年增至3.99×107hm2.2000年進一步增至4.42×107hm2，2001年已達5.26×107hm2.2001年全球轉基因作物按作物種類統計為：大豆占46%，棉花占20%，油菜占11%，玉米占7%；按國家統計：美國占70%（面積，下同）、阿根廷占22%、加拿大占6%、中國占1%～3％，上述4國占全球轉基因作物種植面積的99%；按目標性狀分類：抗除草劑轉基因作物占77%，抗蟲轉基因作物占15%.據統計，1999年美國轉基因大豆、棉花和玉米的種植面積，分別占該國相應作物種植面積的55%、50%和30%。

轉基因作物具有巨大的經濟效益，1997年美國轉基因抗蟲棉種植面積為1×106hm2，平均增產70%，每公頃抗蟲棉可增加凈收益83美元，直接經濟效益近1億美元；1998年美國種植轉基因抗蟲玉米達5×106hm2，平均增產9%，其凈收益為68.1美元／hm2，可產生直接經濟效益3.4億美元。1995年全球轉基因作物的銷售額僅為0.75億美元，1998年達到12億美元～15億美元，2000年已達30億美元，5年間增加了40倍。預計2005年將達60億美元，2010年將達到200億美元。

2.植物用轉基因微生物

自上世紀80年代以來，重組農業微生物工程研究取得了突破性進展，其中新型重組固氮微生物研究已進入田間試驗，一些殺蟲、防病遺傳工程微生物進入田間試驗或商業化生產。防凍害基因工程菌株已于1987年進入田間試驗，防治果樹根癌病工程菌株也于1991年和1992年先后在澳大利亞和美國獲準登記，目前已在澳大利亞、美國、加拿大和西歐一些國家銷售，這是世界上首例商品化生產的植病生防基因工程細菌制劑。具有殺蟲活性的轉B.t基因工程細菌，自1991年起已有多個產品進入市場。在高銨條件下仍保持良好固氮能力的耐銨工程菌株，也進入田間試驗。

3.轉基因動物

轉基因動物主要應用于以下幾個方面：改良動物品種和生產性能；生產人藥用蛋白和營養保健蛋白；生產人用器官移植的異種供體；建立疾病和藥物篩選模型；生產新型生物材料等。1998年全球動物生物技術產品總銷售額約為6.2億美元，預計2010年總銷售額將達到110億美元，其中75億美元是轉基因動物產品。

4. 獸用基因工程生物制品

獸用基因工程生物制品是指利用重組DNA技術生產的獸用免疫制劑。主要包括：單克隆抗體等診斷試劑，目前國內外正在研究、開發或已應用的單克隆抗體診斷試劑已達1000多種；基因工程疫苗，已有44例獲準進行商品化生產，其中重組亞單位疫苗30例，基因缺失活疫苗12例，基因重組活疫苗2例。此外，還有DNA疫苗和獸用基因植物源生物制品等。

5. 轉基因水生生物

迄今為止，全世界研究的轉基因水生生物達20余種，已有8種進入中間試驗，其中我國有一種兩例，僅有大西洋鮭1種可能已開始小規模商品化生產。

6. 我國農業轉基因生物研發現狀與產業化概況

我國轉基因植物的研究開發始于20世紀80年代，1986年啟動的863高新技術計劃起到了關鍵性的導向、帶動和輻射作用。據1996年統計，國內正在研究和開發的轉基因植物約47種，涉及各類基因103種。1997年～1999年，有26例轉基因植物獲準進行商業化生產。按轉基因性狀分：抗蟲16例，抗病毒9例，改良品質1例。按作物劃分：棉16例，番茄5例，甜椒4例，矮牽牛1例。

轉基因抗蟲棉是國內植物基因工程應用于農業生產的第一個成功范例，使我國成為繼美國之后獨立研制成抗蟲棉，并具有自主知識產權的第二個國家。1998年～2001年4年累計種植逾1.3×106hm2，減少農藥使用量70%以上，產生了巨大的社會、經濟和生態效益。由于其傘形輻射的帶動作用，抗蟲轉基因水稻、玉米、楊樹等一批后繼轉基因產品正在進行田間試驗，蓄勢待發。轉基因技術將使農業產業發生深刻的結構變化，向農業與醫藥、農業與食品、農業與加工結合的方向發展。

我國植物用轉基因微生物研究已取得長足進展，正在研發的防病殺蟲微生物13種，涉及基因16種；固氮微生物8種，涉及基因12種，大多已進入中間試驗和環境釋放試驗。我國獸用基因工程生物制品研究與產業化進展迅速，已有近70種單克隆抗體等診斷試劑投放市場，2例基因工程疫苗獲準進行商品化生產，其中重組亞單位疫苗1例，基因重組活疫苗1例。

篇7

根據抗原性質可分為滅活疫苗、弱毒活疫苗、亞單位疫苗、工程疫苗、核酸疫苗和轉基因植物可飼疫苗；根據疫苗功效則可分為預防性疫苗和治療性疫苗。

1. 滅活疫苗。將分類離培養的病原微生物（多數為強毒株）用適當的化學試劑將其滅活但保留其免疫原性，與不同的佐劑混合后乳化制成滅活疫苗。目前，用于制備滅活疫苗的佐劑有礦物油佐劑和氫氧化鋁佐劑。前者多用于病毒性疫苗，如當前使用的豬圓環病毒滅活疫苗、偽狂犬病毒滅活疫苗；用氫氧化鋁作為佐劑制備疫苗靜置后，會出現分層，疫苗在使用前搖勻即可，該佐劑多用于細菌疫苗。蜂膠佐劑多用于細菌苗和亞單位疫苗。

滅活疫苗的用途：①新分離的病原，短期內難以致弱。如高致病性豬藍耳病滅活疫苗、豬圓環病毒滅活疫苗和兔瘟滅活疫苗。②血清型較多的病原，疫苗的保護力呈現血清型特異性，如豬胸膜肺炎放線桿菌（15 個血清型）、副豬嗜血桿菌（15 個血清型）、豬鏈球菌（35 個血清型）等。③變異頻率高的病原，如新分離的口蹄疫Mya-98 株。

豬用滅活疫苗中，有豬偽狂犬病滅活疫苗、豬口蹄疫0 型（單價/ 二價/ 三價）滅活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗、豬圓環病毒滅活疫苗、豬細小病毒滅活疫苗、豬乙腦滅活疫苗、豬鏈球菌病單價( 二價/ 三價) 滅活疫苗、副豬嗜血桿菌三價滅活疫苗和豬傳染性胸膜肺炎三價滅活疫苗等。

滅活疫苗的優點是安全性強，疫苗毒株無毒力返強的危險；多數疫苗的免疫接種效果不受仔豬母源抗體水平高低的干擾；貯存條件方面，一般需冷藏保存，不能冷凍。其缺點是需要免疫次數多，接種后局部反應略大，甚至出現接種部位污染，可引起局部炎癥膿腫，影響接種效果，也降低局部的肉品質量。

2．弱毒活疫苗。

疫苗種類指將毒力下降或毒力完全喪失的病原微生物，與牛奶、明膠等佐劑混合后經過低溫凍干后形成的疏松狀制劑。嚴格意義上，此類疫苗不包含采用基因工程方法對基因組改變后引起致病性改變的微生物制備的弱毒疫苗。根據所含的疫苗毒株分類不同，可以分為以下幾種：（1）細菌活疫苗：如仔豬副傷寒疫苗，豬丹毒- 肺疫活疫苗。（2）病毒活疫苗：豬瘟活疫苗、偽狂犬病活疫苗和豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗。（3）豬支原體肺炎活疫苗。預防豬寄生蟲的活疫苗尚未問世。

我國常用的弱毒活疫苗較多，如豬瘟活疫苗、豬偽狂犬病活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗、豬乙肝疫苗、豬丹毒活疫苗、豬肺疫活疫苗、仔豬副傷寒疫苗、豬馬腺疫鏈球菌活疫苗等。

活疫苗的優點與缺點：優點是：（1）免疫途徑多樣：可通過肌肉注射、滴鼻、口服等途徑免疫。（2）刺激產生黏膜免疫：除肌肉注射外，滴鼻和口服途徑免疫后可刺激機體產生局部分泌型IgA, 形成黏膜免疫，在預防呼吸道感染和消化道感染中具有獨特的作用，這是滅活疫苗無法比擬的，如沙門氏菌口服可以刺激機體腸道局部黏膜免疫。（3）免疫后可剌激產生體液免疫和細胞免疫，免疫效果較為確實。（4）免疫次數少于滅活疫苗。（5）接種后局部反應低。缺點：受母源抗體的影響如豬瘟活疫苗、偽狂犬病活疫苗等；受抗菌藥物的影響如仔豬副傷寒弱毒疫苗、豬丹毒- 肺疫二聯弱毒疫苗和豬支原體弱毒疫苗等；活疫苗運輸保存條件嚴格，需冷凍條件。

3. 基因工程疫苗。

利用分子生物學手段改造病原微生物的基因，獲得毒力下降、喪失的突變株或構建以弱毒株為載體、表達外源基因的重組毒（菌）株，并利用它們作為疫苗毒株制備疫苗，包括基因缺失活疫苗和基因工程活載體疫苗。該疫苗與常規弱毒疫苗相比，主要區別在于后者采用常規技術，而非分子生物學技術，來致弱病原微生物，不確定其毒力致弱的分子機制。

作為基因工程疫苗載體的病毒或細菌，其主要特性是：致病力下降或缺失、對靶動物和非靶動物是安全的，基因組龐大、可容納外源基因，并高效表達。常用的活載體有：偽狂犬病毒弱毒株、腺病毒、沙門氏菌弱毒菌株、乳酸桿菌、胸膜肺炎放線桿菌弱毒株。我國在“十一五”期間，在“863”課題資助下，開展了以偽狂犬病毒為載體，表達豬細小病毒、乙腦病毒、口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒主要免疫原性基因的研究。鑒于對其安全性的憂慮，我國規定轉基因生物（包含基因工程 疫苗）必須經歷實驗室和野外安全性觀察測試，獲得安全證書后，方能進行疫苗學研宄，以申報獸用生物制品新獸藥證書。目前，我國己經批準上市的基因工程疫苗有：豬偽狂犬病基因缺失疫苗、口蹄疫基因工程疫苗、豬大腸桿菌K88-K99 基因工程疫苗。重組載體疫苗尚未正式上市。

4．核酸疫苗。

核酸疫苗產生于20 世紀80 年代。將病原微生物或寄生蟲基因組中編碼免疫原性蛋白的基因克隆到真核表達載體中制備重組質粒，這種質粒直接導入動物體內，利用宿主體內的轉錄翻譯系統，合成該蛋白，剌激機體產生針對相應的細胞免疫和體液抗體，因而稱之為DNA 疫苗。DNA 疫苗可以用大腸桿菌大量制備，成本較低。針對細菌病、病毒病和寄生蟲病的DNA 疫苗報道較多。但基于是否整合到宿主染色體等安全性考慮，核酸疫苗多處于實驗研宄階段，尚未大量應用。RNA 疫苗是近幾年才出現的一種核酸疫苗，主要在人類醫學中，作為RNA 類藥物，用于抗腫瘤研宄。在動物疫苗領域尚未見RNA 疫苗的應用報道。

5. 亞單位疫苗與合成肽疫苗。

利用物理化學方法提純病原微生物中具免疫原性的組份，或者利用基因工程表達該組分，純化后加入佐劑而制成。豬傳染性胸膜肺炎的亞單位疫苗中含有毒素I, 毒素II,毒素III 和外膜蛋白等， 能提供對所有15 個血清型的交叉保護力。我國使用的口蹄疫合成肽疫苗，是利用人工方法合成口蹄疫病毒VP1 蛋白中具有較強免疫原性的抗原片段，加入佐劑制成。該疫苗的優點是抗原組分單一，純度高，免疫反應強，副作用低；能迅速針對新出現變異毒株研制其合成肽疫苗。但是，其成本較高。

6．轉基因植物可飼疫苗。

將病原微生物中編碼免疫蛋白的基因插入植物基因組中，獲得表達病原微生物免疫原性的植物，再從植物中提純蛋白用于注射動物或將植物直接飼喂動物，產生免疫力。用于表達免疫原性基因的植物主要是馬鈴薯、玉米、蔬菜、番茄、煙草和香蕉等，稱為轉基因可飼疫苗（ediable vaccine)。此類疫苗在口蹄疫（擬南芥、苜蓿和馬鈴薯為受體)、豬傳染性胃腸炎（馬鈴薯、花椰菜和土豆為受體)、腹瀉（煙草為受體）和輪狀病毒感染（番茄和馬鈴薯為受體）等疾病防控中有研究的報道,但未見臨床應用。目前的技術難題是：選擇直接生食和貯藏方便的植物作為表達植株（煙草不適用于動物基因的篩選和優化其密碼子和使用合適啟動子，使其表達量滿足疫苗免疫劑量的要求；免疫劑量免疫程序的確定；并設法提高口服后黏膜免疫效果。轉基因植物可飼疫苗主要應用在胃腸道疾病中。

二、疫苗使用的注意事項

1． 建立在正確的流行病學調查基礎上，有針對性選擇所需疫苗，不可盲從。對于多血清型菌株感染，應選擇與當地流行菌株血清型一致的疫苗，免疫效果要確實。

2．確保疫苗運輸和使用過程中的冷鏈保障。如疫苗的物理性狀己經改變，如分層現象，不可用手工混勻后再使用，應丟棄。

3．細菌活疫苗使用前后不可同時使用抗生素或有抗菌活性的中草藥。

4．建議使用于健康豬群；正在發病豬群使用緊急接種，可能會加快處于疾病晚期豬只死亡，但是會縮短豬群的病程，因此要有心理準備。

篇8

【Keywords】 rotavirus; VP6 gene; genes， synthetic; genetic engineering vaccine

【摘要】 目的：設計獲得輪狀病毒（RV）新型VP6基因. 方法：本研究在前期工作的基礎上，對RV VP6基因的優化合成方法進行了探索研究. 我們應用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法對RV VP6基因進行了優化改造. 結果：成功地合成了優化的RV VP6基因cDNA序列，該序列長約1220 bp，(G+C)含量達55%. 結論：與野生型RV VP6基因相比，優化合成的RV VP6基因(G+C) 含量提高了約20%，這一工作為新型高效口服RV基因工程疫苗的深入研究奠定了基礎.

【關鍵詞】 輪狀病毒； VP6基因；基因，合成； 基因工程疫苗

0引言

輪狀病毒（rotavirus， RV）是引起全世界嬰幼兒嚴重腹瀉的重要病原，RV危害嚴重且無有效的治療手段［1］，根除RV感染的惟一途徑是發展安全、有效的疫苗，這已成為一個全球性的公共醫療目標，是一項十分迫切而必要的工作［2-5］. A組RV血清型眾多，VP6蛋白是其主要的組特異性抗原，有較強的抗原性和免疫原性，可誘導保護性免疫. 有研究表明，VP6蛋白的IgA mAb對RV感染具有免疫保護作用，肌注免疫VP6 DNA疫苗可產生較好的異源保護作用［6］，以VP6蛋白和黏膜佐劑免疫小鼠可誘導產生對鼠RV EDIM株的完全保護作用［7］. 根據我國RV的感染狀況，本課題組的疫苗設計方案主要包括A組RV的VP6抗原和A組RV G1，G2和G3型3種不同的VP7抗原. 前期免疫效果研究結果表明，灌胃免疫組產生的RV特異性免疫反應較滴鼻組弱，推測可能與疫苗在胃腸道受到胃酸和消化酶的降解破壞作用，導致其表達量降低和免疫效果弱化有關. 據此，為了發展新型高效的口服RV基因工程疫苗，我們應用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法對RV VP6基因進行了優化合成研究，以期提高其(G+C)含量，可望增加其表達量和提高以其為目標抗原的RV疫苗的免疫效果.

1材料和方法

1.1材料PcDNAⅡ質粒，E.coli DH5α菌種和E.coli DH10B菌種均為本室保存. Agarose Gel DNA purification Kit， Pyrobest DNA polymerase，T4 DNA Ligase， 限制性DNA內切酶KpnⅠ，XhoⅠ，EcoRⅠ，EcoRV，XGal， IPTG， DNA Marker DL2000， dNTP mixture和Amp均為Takara產品；RNA酶為Sigma產品； 酵母提取物和胰蛋白胨為OXOID產品； PEG(4000)為Promega產品.

1.2方法

1.2.1引物合成引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成.

1.2.2RV VP6基因的優化合成根據RV VP6基因的氨基酸序列和人類細胞偏愛的密碼子，重新設計了RV VP6基因的重組cDNA序列，合成了引物P11～P116和P21～P216與sP115和sP216. 根據嵌套式PCR方法制備突變體的原理［8］，我們應用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法人工合成RV VP6基因的重組cDNA序列.

2結果

2.1RV VP6基因S1和S2片段的合成應用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法人工合成RV VP6基因的重組cDNA序列，RV VP6基因全長S片段分為S1和S2片段兩部分先分別合成，再以S1和S2片段為模板，合成RV VP6基因全長S片段，合成策略見圖1，2. 獲得RV VP6基因S1和S2片段（圖3，4），對其進行酶切和測序鑒定（圖5，6），合成片段序列正確.

2.2獲得優化的RV VP6基因全長S片段逐步拼接法獲得了約1220 bp的RV VP6基因全長目的片段（圖7），進行酶切（圖8）和測序鑒定，目的片段序列正確.

1: RV VP6基因全長S片段；2: DNA標準DL2000.

圖7RV VP6基因全長S片段的PCR產物

1: DNA標準DL2000；2: RV VP6基因全長S片段陽性重組質粒.

圖8RV VP6基因全長S片段陽性重組質粒酶切鑒定

2.3RV VP6基因優化改造前后的序列對比分析應用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法成功地優化合成了RV VP6基因. 與優化改造前的野生型序列相比，優化后的RV VP6基因(G+C)含量提高了約20％. 優化改造前后的序列對比和(G+C)含量分析見表1.表1RV VP6基因優化改造前后的序列對比分析

轉貼于 3討論

國內外新型病毒疫苗發展規劃將RV預防性疫苗列為新型病毒疫苗研制的重點項目之一，全球疫苗與免疫接種聯盟（GAVI）和WHO也十分重視中國的口服RV活疫苗，將其列為“全球疫苗腹瀉病控制和免疫規劃”主攻發展的首要疫苗. 為了發展新型高效的口服RV基因工程疫苗， 本研究在前期免疫效果研究工作的基礎上， 針對灌胃免疫組產生的RV特異性免疫反應比滴鼻組弱的問題，分析其原因可能與疫苗在胃腸道受到胃酸和消化酶的降解破壞作用，導致其表達量降低和免疫原性弱化有關，根據有關HIV和DNA序列化學合成的有關研究報道［9-17］，提高目的基因的(G+C)含量可顯著提高其表達量，從而增強其免疫效果. 據此，我們對RV VP6基因優化合成方法進行了探索研究. 根據RV VP6基因的氨基酸序列和人類細胞偏愛的密碼子，我們重新設計了RV VP6基因的cDNA序列，并增加了有助序列正確翻譯的Kozak序列，以提高VP6的表達量. 優化改造的VP6基因重組cDNA序列包含保護性堿基、酶切位點和Kozak序列，共計約1220 bp.

應用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法對RV VP6基因的人工合成方法進行探索，我們發現應用改良的嵌套式PCR策略合成基因時，具體合成方法（逐步拼接法或兩步法）的選擇及基因合成的成功率可能主要取決于引物長度及其彼此間的重疊長度. ①當引物長度

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篇9

目前使用的多為基因工程乙肝疫苗，昔日使用的血源性疫苗已基本淘汰(原因是有引起血源性疾病的嫌疑和浪費大量的血漿)。基因工程乙肝疫苗是利用現代基因工程技術，構建含有乙肝表面抗原基因的重組質粒，它可以用于預防所有已知亞型的乙肝病毒感染。現在用的基因工程乙肝疫苗為乙肝重組脫氧核糖核酸酵母疫苗和重組牛痘病毒疫苗，劑量為每支5微克。

二、為何要打乙肝疫苗?

乙肝疫苗可以成功預防乙肝病毒的感染，新生兒一出生就接種乙肝疫苗，基本可以確保將來不得乙肝。 現有的肝硬化、肝癌多從乙肝發展而來，成功地預防乙肝，實際就是防硬化、防肝癌第一針。目前乙肝疫苗較便宜，每支幾元錢，民眾都能接受。

三、乙肝疫苗的正確使用方法是什么?

；也有采取出生后立即注射1支高效價乙肝免疫球蛋白，及3次乙肝疫苗(每次15微克，生后立即及1月、6月各注射1次)，2個方案保護的成功率都在90%以上。

 

四、接種疫苗后不產生抗體該怎么辦?

五、接種疫苗后，多長時間需要再次接種?

六、乙肝疫苗能和其他疫苗同時使用嗎?

乙肝疫苗可以和流腦疫苗、卡介苗、白百破、脊髓灰質疫苗、乙腦疫苗同時接種，接種程序按照計劃免疫所要求的順序進行。但是乙肝疫苗最好不要和麻疹疫苗同時使用。

七、意外接觸乙肝病毒者如何打乙肝疫苗?

八、接種乙肝疫苗會不會傳染上其他傳染病?

接種肝炎疫苗不會引起其他肝炎發生，也不會被傳染上其他疾病。乙肝疫苗在生產過程中有嚴格的質量標準，其中許多工

序都能殺死血液中包括愛滋病病毒在內的病原微生物，經過臨床觀察是安全可靠的。值得提出的是，使用不合格產品如注射破損、變質疫苗，或注射過程不按無菌要求操作，共用注射器或針頭，可染上肝炎或其他傳染病。還有一部分人原來是隱性傳染者，病毒呈低水平復制狀態，“兩對半”檢查正常，需要用核糖核酸增殖法檢出病毒(hbvdna陽性)，這種人注射疫苗后不會有表面抗體形成。

 

九、如果在邊遠地區，尚無法做到乙肝疫苗的普種怎么辦？

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中圖分類號　S851　文獻標識碼　A　文章編號　1007-5739(2012)02-0325-03

新城疫病毒屬于副粘病毒科副粘病毒屬，為有囊膜的單股負鏈RNA病毒。其基因組編碼6個蛋白：RNA依賴的RNA聚合酶(L基因)、血凝素神經氨酸酶(HN)、融合蛋白(F基因)、基質蛋白(M基因)、磷蛋白(P基因)、白(NP基因)。其中F蛋白有使病毒囊膜與宿主細胞融合進而導致病毒傳人宿主細胞膜的作用，是決定病毒毒力的關鍵因子。而HN蛋白是NDV的另一種重要的致病因子，它的主要作用是參與病毒粒子與細胞受體的最初吸附以及破壞這種吸附作用。此外，HN蛋白還可使F蛋白充分接近受體而發生病毒與細胞膜的融合而致病。因此，NDV表面的HN-F糖蛋白在病毒的傳染性和治病性上起到至關重要的作用，許多新城疫基因工程疫苗的研制都依賴于F、HN蛋白。

新城疫(ND)是一種侵害禽類的急性高度接觸性傳染病，由新城疫病毒引起。自1926年首次在印度尼西亞的爪哇島和英國的新城暴發以來，至今已有4次世界范圍內的大流行，給養禽業帶來了嚴重的經濟損失。NDV基因型已經發生了很大的差異(I-Ⅺ)。雖然現有的滅活苗和弱毒苗能獲得較好的免疫效果，但是近年來由強毒引起的非典型ND在免疫雞群中時有發生，因而研究出安全、高效的新型疫苗一直備受有關學者的關注。目前，亞單位疫苗、活載體疫苗、新城疫病毒載體疫苗、DNA疫苗等都被廣泛研究。

1　常規疫苗

1.1　滅活苗

滅活苗一般是由滅活的感染性尿囊液與載體佐劑混合后制得，能夠刺激機體產生有效的免疫應答，使抗體以較高的水平在體內持續較長時間，且易于儲存。目前，廣泛使用的滅活苗為油乳劑滅活苗，多用Ulster2e、B1、LaSota及Rokin等作毒種來生產，這些毒株在雞胚中均能大量增殖，多用于二聯苗或多聯疫苗的制造，使用多聯苗可以節省勞動力，免疫效力受母源抗體影響較小，免疫后副作用小。但由于注射劑量和疫苗對免疫效果有很大的影響。且滅活疫苗中需要添加Avridine、ISCOMS弗氏完全佐劑、礦物油、動植物油、脂質體等佐劑，導致免疫成本大大提高。同時，接種滅活苗的機體產生針對病毒的特異性抗體，干擾臨床檢測檢疫以及流行病學調查，這是以滅活苗防治ND的最大障礙。

1.2　活疫苗

活疫苗一般由感染胚尿囊液凍干而成，通過飲水、進食、噴霧、氣霧等途徑大規模免疫雞群。通常NDV活疫苗分為緩發型和中發型。B1株和Lasota株是天然弱毒株，幾乎無致病性，可作為緩發型疫苗，經滴鼻、點眼、飲水、氣霧等途徑接種免疫，保護效果較好。而H株、Roakin株等屬中發型的疫苗，由于毒力較強，只能用于二次免疫。也有用CS2株、V4株等作活疫苗的，也能達到良好的免疫效果。活病毒感染能刺激機體產生局部免疫，免疫后可較快得到保護，一般接種后3-5d就能產生抗體，抗體一般可維持20-30d。主要產生黏膜抗體(IgA)，對機體呼吸道、消化道等局部黏膜免疫具有重要作用，是阻止外界病毒入侵的屏障。活疫苗易于大規模使用，較便宜，且疫苗毒還可以使免疫雞傳給未免疫雞，但由于環境條件及并發感染，可能引發疾病，母源抗體對初次免疫影響較大。此外，若在生產過程中控制不當，活疫苗易被滅活、污染，有毒力返強的危險。因此，為了使NDV得到更好的控制，人們又開發了其他類型的疫苗。

2　基因工程疫苗

2.1　亞單位疫苗

利用重組DNA技術輔以佐劑將NDV保護性抗原基因在高效的表達系統中表達而制成亞單位疫苗。目前，桿狀病毒表達系統是研究ND亞單位疫苗的主要常用工具。Nagyetal分別利用昆蟲桿狀病毒表達了NDV的F及HN蛋白，對雛雞進行免疫。結果表明，表達的F和HN蛋白能夠產生很好的免疫保護作用。丁壯等應用該系統表達NDV四平和長春2個分離株的HN，用NDV強毒攻毒后，分別達到65％(四平株)和100％(長春株)的保護率。聞曉波等構建含有NDV的M、NP、F、HN 4個基因的桿狀病毒轉移載體，并得到了共表達的NDV的M、NP、F、HN4個蛋白，為進一步研究亞單位疫苗及NDV結構蛋白之間的相互作用奠定了基礎。Kapczynski et al用處理NDV的不具感染性的病毒HN和F蛋白免疫雞，經驗證這些病毒亞單位成分具有良好的免疫保護效果。亞單位疫苗具有安全性高、穩定性好、運輸方便、批量生產容易的優點。是ND疫苗未來發展的一個重要方向，但是由于生產成本高，價格受限，很難真正用于疫苗生產，除非改進表達技術，顯著降低成本。

2.2　新城疫病毒重組活載體疫苗

近年來，采用以病毒或細菌為載體研究新城疫活疫苗的技術路線被多數學者主張。將NDV F和HN基因在動物病毒弱毒或無毒株(如腺病毒、痘苗病毒、反轉錄病毒等)等載體上進行表達，均已獲得成功。目前，痘病毒、腺病毒和孢疹病毒等都是較為理想的病毒載體。1990年Taylor et al將新城疫病毒Texas株F基因插入禽痘病毒中，在培養細胞中得以表達，經糖基化修飾后切割成F1和F2，通過點眼或口服重組病毒可獲得部分攻毒保護，而通過肌肉注射或翅下刺種，免疫1次就可獲得完全攻毒保護。Morgan et al將NDV的F、HN基因分別克隆人火雞孢疹病毒的復制非，必需區(US2)，利用Rous肉瘤病毒LTR的強啟動子構建重組病毒，用其腹腔接種SPF白來航雞，第28天后肌肉注射攻毒，表達F蛋白的重組病毒的保護率高達90％。曹殿軍等將NDV HN基因在重組雞痘病毒中表達，以NDV強毒株F48E9攻毒發現，接種重組病毒106pfu／只時，保護力可達80％，而104pfu／只時，保護力可達60％。說明該重組病毒對雛雞具有一定的保護作用，且該保護作用與接種劑量有一定的相關性。梁雪芽等將含NDV F48E9株融合蛋白(F)基因的真核表達質粒PCDNA3-F的減毒鼠傷寒沙門氏菌ZJIll株(Z]111／PCDNA3-F)口服接種小鼠和雛雞，表明利用該減毒株作為載體傳遞DNA疫苗具有相對安全性。用ZJlll／PEDNA3-F以108cfu／只免疫雛雞，2周后二免，二免后4周攻擊致死劑量的強毒株F48E9。結果表明：重組zJlll／PCDNA3-F菌株不僅能誘導法氏囊B淋巴細胞和胸腺T淋巴細胞的增值反應，而且能誘導雛雞產生NDV抗體，對強毒攻擊的保護率高于PCDNA3-F裸質粒DNA疫苗注射免疫組(50.00％)，達66.7％。活載體疫苗是當今及未來疫苗開發與研制的主要方向之一，其不僅具有傳統疫苗的許多優點，而且還為多價苗及聯苗的生產開辟了新道路。

2.3　新城疫病毒載體疫苗

隨著反向遺傳學的發展，重組NDV載體已成為當今病毒載體系統研究的熱點之一。基于NDV可以誘導機體的體液免疫和細胞免疫能在體內增值，并長期表達抗原基因，使機體得到較強且較持久的免疫保護，且是一種RNA病毒，不會與宿主基因組整合，安全性較高，被學者們認為是很好的疫苗載體。Zhao et al。吩別在NDV強毒株和弱毒株的4個不同基因間區域插入外源基因，結果表明：NDV作為疫苗載體是完全可行的，因為病毒的復制效率和滴度并沒有受到影響。Peeters et al以含禽副粘病毒4型基因的雜合體HN基因取代NDV HN基因，構建的嵌合體病毒作為活疫苗可以產生對NDV的免疫保護以及對F蛋白的中和抗體，不僅能夠抵制致死劑量NDV的攻擊，而且根據其對HN所產生的抗體及血清分析即可區別于野生毒感染。

2.4　核酸疫苗

核酸疫苗最早是由Wolffet al于1990年發現。他們注意到給小鼠直接肌肉注射質粒DNA，質粒及純化的DNA或RNA重組表達載體，可使載體上的基因在局部肌肉細胞內表達，這種表達可持續數日甚至終身，且沒有檢出注射的外源核酸與宿主染色體的混合，之后William，Tang et al也證實了這一點。1994年其被世界衛生組織(WHO)正式統一命名為核酸疫苗(nuclmc acid vaccine)。它是指把外源基因克隆到真核質粒表達載體上，然后將重組的質粒DNA直接注射到動物體內，使外源基因通過宿主細胞的轉錄系統合成抗原蛋白，刺激機體的免疫系統，使機體產生特異性的體液免疫和細胞免疫應答。