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采用肝癌球體細胞篩選鑒定識別肝癌干細胞的單抗
關鍵詞：肝癌 腫瘤干細胞 單克隆抗體 cd90
摘要：目的采用肝癌球體細胞篩選鑒定識別肝癌干細胞的單抗,為靶向腫瘤干細胞治療肝癌提供候選治療單抗。方法采用無血清懸浮培養的方法富集培養肝癌干細胞。通過細胞免疫熒光、順鉑耐藥實驗、Real-timePCR、裸鼠皮下成瘤實驗等方法篩選、鑒定抗肝癌干細胞單抗。采用免疫組織化學的方法鑒定單抗識別的抗原在肝癌組織中的表達情況。質譜鑒定抗原。結果MHCC97L細胞能在無血清懸浮培養條件下形成細胞球,并能被PKH26染料標記。流式細胞檢測發現MHCC97L球體細胞中CD90表達比例較親本細胞提高了3.4倍。無血清成球抑制實驗獲得6株顯著抑制MHCC97L細胞在無血清成球的單抗,抑制率分別為54.67%,50.33%,45.73%,42.26%,39.11%,37.63%。細胞免疫熒光結果顯示單抗28C10和CD90在MHCC97L細胞中能共定位。Real-TimePCR檢測結果顯示MHCC97L28C10^+細胞Sox-2和Oct-4表達顯著高于MHCC97L28C10-細胞。流式細胞檢測,在MHCC97L及其sphere細胞中28C10^+細胞比例分別為7.98%和10.7%,28C10^+細胞比例提高了1.34倍。流式細胞術分選獲得的28C10^+細胞的體外成球能力、侵襲能力顯著高于28C10-細胞。CCK-8法檢測結果顯示28C10^+細胞較28C10-細胞顯示出對化療藥物順鉑的耐藥,IC50分別為1.96μg/mL和1.16μg/mL。裸鼠致瘤實驗結果顯示,28C10^+細胞裸鼠皮下接種2×10^4cells/只,2個月可形成腫瘤,成瘤率為40%。另外1只未形成腫瘤的裸鼠形成了肺部轉移灶(1/5)。免疫組化檢測顯示單抗28C10的靶抗原陽性率為72.0%(77/107),而在癌旁組織中低表達,差異有統計學意義。質譜結果顯示28C10識別的抗原為HSP90α。結論采用MHCC97L球體細胞模型成功鑒定一株特異識別肝癌干細胞的單抗,為靶向肝癌干細胞的抗體治療奠定基礎。
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