Sedlin突變體的表達(dá)及其與RB1在細(xì)胞中的共定位
關(guān)鍵詞：突變體 質(zhì)粒構(gòu)建 蛋白表達(dá) 免疫熒光
摘要：目的構(gòu)建脊椎骨骺發(fā)育不良蛋白(Sedlin)的缺失突變和點(diǎn)突變體質(zhì)粒,檢測(cè)其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、定位及其與RB1蛋白的共定位情況,為后續(xù)研究蛋白質(zhì)相互作用提供依據(jù)。方法以Sedlin全長(zhǎng)cDNA序列為模板,擴(kuò)增目的基因序列,連接至表達(dá)載體,構(gòu)建3個(gè)原核表達(dá)質(zhì)粒,即pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F和相應(yīng)的真核表達(dá)質(zhì)粒,即pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F。分別轉(zhuǎn)化pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、谷胱甘肽瓊脂糖球珠純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)染色法檢測(cè)其表達(dá)情況;分別轉(zhuǎn)染pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F于HEK 293T細(xì)胞,Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況;分別單轉(zhuǎn)pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F以及將上述質(zhì)粒與pDNA3.1-FLAG-RB1共轉(zhuǎn)到COS7細(xì)胞中,進(jìn)行免疫熒光制片,觀察其在真核細(xì)胞內(nèi)的定位情況。結(jié)果測(cè)序結(jié)果顯示pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F和pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F重組質(zhì)粒構(gòu)建成功;考馬斯亮藍(lán)染色顯示融合蛋白GST-SedlinN/Y115A/Y115F在BL21細(xì)胞中能夠大量表達(dá);Western blot結(jié)果顯示GFP-SedlinN/Y115A/Y115F在HEK 293T細(xì)胞中能夠高效表達(dá);免疫熒光結(jié)果顯示GFP-SedlinN/Y115A/Y115F蛋白在COS7細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布,并與RB1蛋白存在明顯的核內(nèi)共定位。結(jié)論人Sedlin及其突變體在BL21菌株和HEK 293T細(xì)胞中均能有效表達(dá);在COS7細(xì)胞中,Sedlin主要表達(dá)于細(xì)胞核,而Sedlin突變體除在細(xì)胞核中表達(dá)外,在細(xì)胞質(zhì)中也有相當(dāng)量的表達(dá),Sedlin及其突變體均與RB1蛋白共定位,顯示Sedlin羧基端以及NPFY基序中的Y磷酸化與否并不影響與RB1蛋白的共定位。
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